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巨噬細胞（Macrophages）是一種位于組織內的白血球，源自單核細胞，單核細胞來源于骨髓中的前體細胞。巨噬細胞在生物體內扮演著多重角色，它們可以吞噬和清除異物和衰老死亡細胞、分泌生物活性物質、調節(jié)血細胞生成和參與免疫應答等，是一類在體內發(fā)揮重要免疫效應的細胞，并且也是實驗室最-常用的細胞種類之一。
骨髓來源巨噬細胞（Bone Marrow Derived Macrophage）是從大鼠或者其他哺乳動物骨髓中的單個核細胞經細胞因子誘導分化得到的一種原代巨噬細胞。本期，我們將以大鼠為例，分享骨髓來源巨噬細胞分離提取和培養(yǎng)注意事項，幫助您順利上手開展實驗。
分離提取步驟
一、分離脛骨和股骨
取2周齡的健康大鼠，斷頸法處死；
用超純水清洗大鼠2次，再用75%酒精浸泡5 min，進行表面除菌處理；
將消毒后的動物轉運至超凈工作臺內；
無菌條件下，用第一套無菌剪刀和鑷子剪開腿部皮膚，充分暴露兩側股骨；
更換第二套無菌剪刀和鑷子，從大腿根部關節(jié)處和腳后跟關節(jié)處剪斷，分離腿部肌肉，取出脛骨和股骨，將其放在含有PBS的培養(yǎng)皿內。
圖1. 分離的脛骨和股骨
二、沖洗骨髓
更換第三套無菌剪刀和鑷子，清理脛骨和股骨表面殘留的肌肉組織，注意保證骨頭完整；
留取純凈骨頭，將其轉移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內；
取一個新培養(yǎng)皿，加10 mL大鼠骨髓來源巨噬細胞完-全培養(yǎng)基（貨號CM-R141）備用；
更換第四套無菌剪刀和鑷子，先用鑷子固定骨頭，再用無菌剪刀剪下骨頭兩端；
用注射器吸取培養(yǎng)皿內的完-全培養(yǎng)基，從骨頭一端插入針頭，反復沖洗骨髓至骨頭發(fā)白透亮，將骨髓液收集在培養(yǎng)皿內；
用5 mL移液槍反復吹打骨髓液，將骨髓液經200目細胞篩過濾，濾液收集于離心管內，離心棄上清，獲得骨髓細胞沉淀。
圖2. 注射器沖洗骨髓
三、巨噬細胞誘導分化
用含M-CSF（巨噬細胞集落刺激因子）的培養(yǎng)基刺激骨髓單個核細胞分化為巨噬細胞。
M-CSF有兩種獲取方式：
購買商品化的M-CSF因子（推薦貨號：PCK042、PCK043、PCK044、PCK303）。M-CSF的常用濃度范圍為10-50 ng/mL，不同品牌的細胞因子使用濃度可能有所差異，需根據實際誘導效果調整使用濃度；
使用培養(yǎng)5-7天的L-929細胞上清[1]。將獲得的L-929細胞培養(yǎng)上清高速離心除雜，分裝后置于-20℃冷凍保存。通常使用含有20% L-929細胞上清的完-全培養(yǎng)基進行誘導，同時可根據實際誘導效果，調整L-929細胞上清的含量。
圖3. 誘導完成的骨髓來源巨噬細胞
細胞培養(yǎng)注意事項
骨髓來源巨噬細胞體外培養(yǎng)不增殖，需注意培養(yǎng)時間，建議盡快進行相關實驗；
骨髓來源巨噬細胞難消化，可用利多-卡因消化3 min左右（不建議超過5min），若細胞仍無法消化，更換消化液為0.25%胰蛋白酶，或使用無菌細胞刮。
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