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細胞學堂 | 貼壁細胞6大培養難題原因和解決方法

更新時間:2023-03-24  |  點擊率:2721

貼壁細胞在培養時要貼附于培養(瓶)器皿壁上,細胞一經貼壁就迅速鋪展,然后開始有絲分裂,并很快進入對數生長期。

貼壁細胞因其培養過程較為繁瑣,所以培養時更容易出現問題。以下總結了貼壁細胞培養中常見的6種問題,并詳細介紹原因和解決方法,若培養時遇到這些情況,可參考對應解決方法處理。


01


傳代后細胞全部飄起


解決方法:檢查所使用的培養基的顏色是否偏紫色(如圖1),檢查瓶蓋是否透氣,不透氣瓶蓋是否被擰松。


圖片

圖1. 培養基顏色偏紫


通常培養基偏堿,顏色就會偏紫,主要是因為培養基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫,培養基量太少,或培養基存放時間太長時都會變堿。建議配好完-全培養基后分裝到50mL離心管并于一周內用完,量少時放到15mL離心管里保存



02


傳代后部分細胞漂浮


原因及解決方法如下

1

傳代前細胞密度太大:一般細胞匯合度達到80%時可進行傳代操作,傳代密度需適中,傳代密度過高也會導致傳代后漂浮;


2

細胞狀態不好:可通過提高血清比例、穩定培養環境等方法進行改善;


3

吹打次數過多造成機械損傷:輕柔吹打,細胞呈單顆粒時可停止吹打,吹打過程避免氣泡產生;


4

培養基更換后不適應:更換回原來的培養基;或者與原培養基比例混合后使用,使細胞有個適應期。



03


傳代后細胞變形


原因及解決方法如下

1)變形,但細胞還在生長:可能是血清批次不一樣導致,血清成分復雜,不同批次和品牌間均存在成分差異,影響細胞狀態。建議使用同一批次血清,更換血清時需與原血清比例混合后使用,使細胞有過渡期;

2)變形,但細胞不長,且碎片增多:可能傳代操作過程損傷,常見于消化不當,或者潛在支原體等污染導致細胞病態;消化時間根據每個細胞的狀態來調整,消化過度或者消化不充分均會對細胞造成影響;培養過程應嚴格無菌操作,實驗環境盡量潔凈,確保細胞無外源污染。




04


細胞生長周期變慢,邊養邊漂


原因及解決方法如下

細胞傳代時密度太稀或太密:建議細胞密度達80%左右進行傳代,傳代密度適中,密度過低會延長生長周期;

傳代操作不當:根據細胞特性決定細胞消化時間,一般在顯微鏡下觀察細胞回縮變圓并有少量細胞脫落即可終止消化,難消化的細胞可分次消化,每次時間不超過5min;頻繁換液或者清洗細胞也會導致細胞狀態變差,常規換液時間間隔為2~3天。



05


傳代后細胞成團


解決方法如下

1

低密度接種,延長換液時間,防止細胞脫落;


2

使用多聚賴氨酸包被培養器皿,以增加細胞貼壁牢固度,降低細胞聚集成團的幾率;


3

重新鋪板,并更換新配制的培養基,加大血清比例(增加比例不超過5%);


4

接種時,減少培養基量(如T25加3mL)以加快細胞貼壁速度,等待細胞貼壁后(約8-12小時),再補加培養基到正常用量。



06


細胞出現空泡


原因及解決方法如下

1)正常的細胞活動:有的細胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動,無需特殊處理(如Caco-2細胞);

2)血清不適應、培養基成分改變、換液不及時等造成細胞營養不良:可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決;

3)機械損傷、PH偏高或偏低等造成細胞受損:注意培養條件及操作手法。




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